响应面法优化川芎蛋白提取工艺及抗氧化活性研究（三）

2.2.3 因素交互作用

利用DesignExpert8.0.6，面法根据回归方程，优化氧化研究生成等高线和响应面图，川芎并考察拟合响应曲面的蛋白形状，分析pH、工艺料液比、及抗提取时间对LCP得率的活性影响。在响应面图中，面法曲线变化越陡峭，优化氧化研究说明交互影响越显著。川芎从图2～图4可见，蛋白三个因素在所选范围内存在极值，工艺即等高线中最小椭圆的及抗中心点。结果表明，活性BC交互作用显著，面法与F值结果一致。

2.2.4 验证试验

经软件分析，该模型得到的最优条件为：料液比1:15.65（g/mL）、提取时间1.58h、pH6.23。且预测LCP得率理论值为2.35%。考虑到实际操作的可能性，将试验条件修正为：料液比为1:15（g/mL）、提取时间1.5h、pH6。在该修正条件下进行3次提取试验，平均蛋白质得率为（2.36%±0.13%），接近理论值。表明该数学模型可用于优化LCP质提取过程。

2.3 SDS-PAGE凝胶电泳

实验结果如图5所示，Tris-HCl所提LCP的分子量分布在17～48kDa之间，较之月见草蛋白（16～200kDa）、榴莲蛋白（20～100kDa）、向日葵蛋白（300～350kDa）、扁豆蛋白（50～80kDa），LCP分子量较小。有研究提取不同蘑菇中的蛋白质并进行抗氧化研究，结果表明分子量较小的蛋白质抗氧化能力较强。活性氧自由基可以诱导蛋白质发生过氧化反应，因其易与蛋白质或蛋白质衍生化合物相关的反应可能发生在含有组氨酸的侧链上，使蛋白质分子具有抗氧化活性。

2.4 等电点测定

在等电pH条件下，蛋白质分子上的电荷缺失降低了蛋白质分子之间的排斥力，从而促进了蛋白质与蛋白质之间的相互作用，蛋白质沉淀，溶解性降低，最终降低其他功能特性。试验中制备的LCP提取物在pH为3.88时沉淀最多，如图6所示，pH3.88与其余pH的蛋白沉淀量之间存在显著差异（P＜0.05），因此pH3.88可能是LCP的pI，这可以为分离和纯化中选择离子交换剂或凝胶色谱试剂及后续研究提供基础，因等电点附近加热可以更好地控制蛋白质的溶解度，可通过加热控制蛋白质变性和聚集的程度来增强蛋白质的功能。

2.5 溶解度

蛋白质溶解度是蛋白质变性和结构改变程度的指标，也是蛋白质功能的良好指标。pH为8（图7）时，LCP的溶解度为96%。LCP在pH3～4之间溶解度最小，当pH偏离pI时，蛋白溶解度增大。在pH8下观察到较高的溶解度，可能是由于高pH条件下LCP部分水解导致末端残基增多，这些残基有利于蛋白质分子与水的亲水性相互作用，如氢键和静电相互作用。

2.6 LCP体外抗氧化试验

由图8（a）可知，在0.3～1.5mg/mL范围内，LCP的羟自由基清除能力随着浓度的增大而增强，当其浓度达到1.5mg/mL时，羟自由基清除率为60%。阳性对照组V_C的IC₅₀值为0.72mg/mL，计算得到LCP清除羟自由基的IC₅₀值为1.18mg/mL，由此可知，虽清除效果弱于阳性对照组，LCP具有一定的羟自由基清除能力。
 

由图8（b）可知，LCP对超氧阴离子自由基的清除能力在0.3～1.5mg/mL的浓度范围内随着浓度的增大而增强，呈现较为明显的量效关系，当其浓度达到1.5mg/mL时，超氧阴离子自由基清除率达到78%，清除能力与1.5mg/mLV_C相当。通过计算可知LCP清除超氧阴离子自由基的IC₅₀值为0.57mg/mL，V_C的IC₅₀值0.26mg/mL。由实验结果可知，LCP具有良好的超氧阴离子清除能力，并呈剂量依赖性，活性随蛋白质浓度的增加而增加，但不呈线性关系，推测是蛋白质不完全溶解所致。而超氧自由基能间接诱导脂质氧化而促进动脉粥样硬化斑块的发展和生长。推测LCP可作为一种潜在的预防心血管疾病的天然抗氧化剂进一步研究。

由图8（c）可知，随着浓度的增加，LCP的DPPH自由基清除率逐渐增大，二者呈正相关性，当浓度为1.5mg/mL时，DPPH自由基清除率达到最大值58.3%。但与阳性对照组V_C（IC₅₀值为0.16mg/mL）相比，LCP（IC₅₀值为1.31mg/mL）清除羟自由基的能力较弱，推测LCP可能含有较高疏水氨基酸所致。

LCP显示出良好的抗氧化活性，可能是由于LCP中含的氨基酸部分水解，能够向自由基提供质子，从而显示出抗氧化能力；在适当的pH条件下提取的LCP，属小分子量的蛋白质，亦可能是增强抗氧化活性的一个原因。

3 结论

蛋白来源丰富，种类繁多，在食品及医疗行业的应用广泛。天然蛋白质是动植物体内的重要大分子物质，具有维持细胞表面或细胞内识别、细胞粘附、蛋白质的加工和转移等生物活性功能和生物活性。本研究首次从中药川芎中分离蛋白质，单因素结合响应面法优化LCP提取工艺结果表明，在pH6、料液比1:15、提取1.5h条件下提取LCP，得率为（2.36%±0.13%），Tris-HCl法可以用于LCP提取。同时对其理化特性进行了研究，SDS-PAGE电泳表明，LCP的分子量分布在17～48kDa之间。LCP的pI约为pH3.88；pH为8时，LCP的溶解度为96%。通过探索的LCP的分子量、等电点、溶解度等功能特性，可为其进一步研究提供一定的研究基础，为其在食品工业等领域的应用提供理论依据。

机体细胞的癌变，衰老及其它疾病都与机体内自由基的过量产生有直接的密切联系。本研究结果显示，LCP具有良好的抗氧化活性，羟自由基清除能力IC₅₀为1.18mg/mL、超氧阴离子自由基清除能力IC₅₀为0.57mg/mL、1，1-二苯基-2-苦基肼基（DPPH）自由基清除能力IC₅₀为1.31mg/mL。且属于天然产物，具有比较高的安全性，可作为一种潜在的天然抗氧化剂源。本研究为川芎合理开发和应用提供了一些基础资料，也为开发植物源的天然抗氧剂奠定了良好的基础。

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